高效液相色譜 ( HPLC)廣泛應用于醫藥衛生、食品安全、環境化學等各個領域。在使用過程中難免會遇到各種各樣的問題，從而影響正常工作，如何快速發現故障、排除故障，并做好預防維護措施及其重要，本文列舉了常見故障的排除及解決方法，僅供大家參考。

故障排除原則

在儀器序列運行過程中發生故障時按發現故障、停止儀器序列運行、故障信息登記、確認故障來源、解除故障、故障維修登記、做好預防維護措施等步驟進行故障排查及解除故障，在故障排除過程中可遵循以下原則：

原則一：從簡單因素入手；
原則二：一次只變化一個因素，利于確認因素與問題之間的關系；
原則三：記錄儀器正常狀態的參數及異常狀態信息，完整的記錄是故障排除的關鍵步驟；
原則四：做好預防措施，加強儀器操作培訓，正確的、良好的操作習慣是降低儀器故障率的首要條件。

常見故障排除

1、壓力高

壓力偏高或超過壓力上限一般是由方法問題、誤操作、系統堵塞、壓力傳感器故障等問題引起。

方法問題：在方法建立時柱溫、流速等參數建立不當，當使用小粒徑色譜柱或背壓大的色譜柱時，可降低流速或升高柱溫（如35～40℃），以降低系統壓力，該問題多發生在建立方法時。
誤操作：當壓力高于平時壓力時首先檢查柱溫是否設置錯誤、流動相溶劑是否使用錯誤（如錯將甲醇用成了粘度高的乙腈）、色譜柱是否拿錯等誤操作。
系統堵塞：排除方法問題及誤操作后，排查是否系統堵塞，進行分段排查，可依次松開管路接頭，從HPLC出口端開始，向上游泵逐個檢查，這是發現堵塞部位簡單的方法，確定堵塞部位后可進行直接更換、或超聲清洗、或反沖（如六通閥、進樣針、針座、管路等部位），如超聲清洗或反沖無效則需更換，經排查是保護柱或色譜柱堵塞時按相關方法沖洗。

壓力傳感器故障：上述排查后未發現壓力高原因，則需要更換壓力傳感器，聯系儀器客服咨詢。
2、壓力低
壓力偏低或無壓力一般是由誤操作、漏夜、泵不輸液等問題引起。
誤操作：泵關閉、打開了排空閥等誤操作引起無壓力、柱溫設置錯誤、用錯溶劑、用錯色譜柱等誤操作可能導致壓力偏低或偏高。
漏夜：壓力偏低或無壓力很多時候是由漏夜引起，配有漏夜感應器先確認哪個模塊漏夜報錯（此時已經嚴重漏夜），清除錯誤后重新啟動泵排查該模塊漏夜位置（用濾紙或紙巾逐個接口試漏），未配有漏夜感應器或輕微漏夜時由泵至檢測器逐個接口排查（漏夜多發生在色譜柱接口及泵各接口）。確定漏夜位置根據漏夜原因進行處理，如接口松動重新擰緊、如密封圈磨損更換密封圈等。
泵不輸液：流動相走空、管路中有空氣、未充分排空、溶劑入口過濾頭堵塞、單向閥污染均可能引起泵不輸液。首先檢查溶劑瓶內是否有溶劑、管路中是否充滿氣體，進行排空（如排空廢液口無液體流出使用注射器手動抽，至有連續液體流出）；排空后依然無壓力、壓力偏低或壓力波動，且廢液口無廢液流出，超聲清洗單向閥或更換單向閥，無改善將溶劑入口過濾頭取下，查看壓力是否正常，如濾頭堵塞超聲清洗或更換（注：安捷倫溶劑入口過濾頭為陶瓷材質，不可以超聲，使用1%～10%硝酸浸泡過夜）。
3、壓力波動
排氣不充分或未排氣、脫氣機未開或故障、流動相中溶劑不互溶或易揮發、溶劑入口過濾頭部分堵塞、單向閥污染、漏夜等均可導致壓力波動。
排空不充分或未排空：發現壓力波動首先進行流動相排空，一般排空后壓力正常。
脫氣機未開或故障：外置脫氣機檢查電源是否打開或報錯（如安捷倫1100、1200，島津20AT、20AD為外置脫氣機）；內置脫氣機檢查泵是否有報錯信息（如安捷倫1260等為內置脫氣機）；waters e2695為內置脫氣機在控制面板可以控制脫氣機開關，需檢查開關是否打開，壓力是否小于1psi。
流動相中溶劑不互溶或易揮發：檢查緩沖鹽稱量是否正確、是否混合均勻，檢查溶劑是否互溶。
溶劑入口過濾頭部分堵塞：查看溶劑入口過濾頭周圍是否有大量氣泡，如果有大量氣泡可能過濾頭較臟，超聲清洗，安捷倫陶瓷濾頭用久了會變黑，取下1%～10%硝酸浸泡過夜。
單向閥污染：如排空后壓力波動依然較大，取下單向閥超聲清洗，多數情況可以解決。
漏夜：多數為柱塞桿密封圈磨損導致漏液，配有在線清洗時檢查在線清洗液是否有明顯增加（清洗液循環使用的），查看在線清洗管路出口端，在未清洗時是否有液體緩慢流出，如有液體流出說明，柱塞桿密封圈磨損導致漏液，更換密封圈或柱塞桿及密封圈。
4、保留時間變動
如果所有峰（色譜峰）的保留時間均發生了變化，其原因很可能是流動相的組成、色譜柱的化學性質、色譜柱的溫度或流速、在線混合時比例閥故障等。
流動相的組成：如果操作人員操作不當，則會導致流動相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統時，流動相混合物（系統）設置不正確；或替換新批次流動相時，未妥善制備新的流動相（新流動相配制不正確）。在極少數情況下，會出現流動相組分選擇性損失的情況，例如蒸發。
當流動相發生變化時，峰形（色譜峰）通常會向相同的方向移動，以縮短或延長保留時間（保留時間變長或變短）；而相對保留通常會發生變化。檢查流動相組成錯誤的較佳方法是仔細檢查（復查）系統設置；如有必要，應制備新的流動相。
如果您懷疑設備出現故障，請將色譜柱和流動相移至另一個HPLC系統，然后再次運行。如果問題依然存在，則問題在于流動相或色譜柱；如果問題不再出現，則可能與儀器硬件故障或參數相關。
色譜柱化學（化學性質）變化：一般會在色譜柱使用數周或數月內逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。更換新柱以確定是否是柱老化導致的保留時間變動。
色譜柱溫度變化：柱溫變化會導致保留時間的變化，每1℃的溫度變化會引起1-3％的保留時間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），實驗室溫度通常會變化。尤其是當供暖或空調通風口直接吹向系統時，溫度變化極為明顯。使用柱溫箱可以避免色譜柱出現這樣的溫度問題，且HPLC系統應遠離通風口放置。
流速變化：可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導致流速與設定值發生變化，導致保留時間變化。
氣泡問題：可能伴有柱壓過低或柱壓波動，且保留時間延長。對于雙頭泵，如果只有一個泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會發生脈動。
泄漏也會延長保留時間。查看接頭如有液滴或結晶析出，可證明有泄露。請特別注意色譜柱之前的接頭。如果使用不銹鋼配件，通常將接頭螺母手動擰緊，再扳手擰緊1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接頭時，應停止泵，松開接頭，將管路推到接口端口的底部，再擰緊接頭。擰緊PEEK接頭時如果存在流動的液體，會導致管道在配件中滑動，產生柱外死體積，進而影響分離效果。
單向閥污染或泵密圈磨損會導致流量偏低或波動，從而導致保留時間變化。單向閥污染可以進行超聲清洗，隨著使用時間的增加，泵密封圈會出現磨損，而且使用高濃度緩沖鹽為流動相，會縮短泵密圈的使用壽命，可以根據使用情況及密封圈故障率定期更換密封圈，通常一年更換一次即可。
比例閥和在線混合發生故障會降低梯度洗脫的效果，從而導致保留時間變化，下面介紹了一種檢查流動相配比精度的簡單方法：將色譜柱柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道，流動相A為水，流動相B為0.1％丙酮的水，檢測器波長設置為265nm，并使用足夠高的流速使單向閥能夠有效工作（例如2mL/min）。以10％為增量進行梯度變化（如流動相B由10％、20％、30％……90％至100％）。其結果應是平滑的階梯狀。
5、峰形問題
峰形常見問題有拖尾峰、伸舌峰、分叉峰、鬼峰等。
拖尾峰：
（1）堿性化合物與硅膠顆粒表面上的酸性或離子化硅烷醇基團之間相互作用而導致拖尾，選擇經封端處理的色譜柱、添加掃尾劑如三乙胺，可以改善拖尾。
（2）緩沖液或離子對試劑濃度低也會導致峰拖尾，緩沖液主要用來使樣品保持恒定的離子化狀態，從而穩定保留時間，并在較大程度上減少因離子相互作用而導致的峰拖尾現象。緩沖液和離子對試劑的一個共同特征是作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時間的穩定）會從低濃度開始顯現，并隨著濃度的增加而繼續作用增加，但會逐漸維持在一個穩定水平。穩定水平之下的緩沖鹽或離子對濃度，可以保持穩定的運行；濃度過高可能導致溶解性問題，新藥特別注意。
（3）柱篩板堵塞引起峰拖尾或變形：柱篩板堵塞會影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動路徑到達色譜柱，因此會晚于另一部分樣品。由于此時未發生分離，因此所有分析物會以相同的方式變形（被擾亂），進而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。
（4）死體積過大：當相同方法轉移至其它儀器時出現色譜圖中所有峰拖尾或變形可以排查是否死體積增大導致，管路長度、內徑、接口處是否擰緊均可改變死體積。
伸舌峰（前拖峰）：
伸舌峰一般是由柱過載、柱結構塌陷、接口處死體積渦流、樣品溶劑與流動相不兼容、柱溫低等因素導致的。柱過窄、樣品溶劑與流動相不兼容、柱溫低等因素產生的伸舌峰一般發生在方法開發期間，需要篩選適合的柱溫、稀釋劑及進樣濃度；穩定的方法忽然出現伸舌峰需要排查色譜柱是否塌陷及管路接口處是否對接緊密，特別注意色譜柱接口處，接口處的死體積容易產生渦流，導致伸舌峰。

分叉峰：

（1）色譜柱或保護柱入口端污染：如安裝保護柱可不接保護柱或更換新的保護柱來排除，再更換新的色譜柱進行排除，確認是色譜柱污染，進行沖洗，沖洗無效，對色譜柱進行再生或更換色譜柱。
（2）篩板堵塞：關注色譜柱壓力，如高于之前的壓力，可能篩板堵塞，反沖色譜柱或更換色譜柱排查。
（3）樣品稀釋劑與流動相不兼容：在方法開發其間出現分叉峰時需要排查稀釋劑與流動相的兼容性，建議選擇流動相作為稀釋劑，在日常檢測中需要排查是否用錯稀釋劑。
（4）干擾峰：可能是樣品中純在的物質與目標物為分離，需要調節方法（調節流動相或更換色譜柱）改變選擇性，可能是系統中引入的污染物，通過空白溶液可以排查。
（5）色譜柱過載：選擇高容量的色譜柱或降低進樣濃度。

鬼峰：主要來源于溶劑污染（包括流動相、稀釋劑等）、色譜柱污染、進樣器污染、氣泡、配樣污染（移液、定容等過程）、上針殘留等，如鬼峰出現在空白溶液，且多針重現，可通過進空針、更換洗針液、更換色譜柱、更換儀器、重配流動相等篩選引起鬼峰位置；如鬼峰出現在樣品溶液中，可能是上針殘留、氣泡、及配樣污染。